啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力測(cè)定原理
1、細(xì)胞破壁：就酶在生物體內(nèi)的分布，可分為胞內(nèi)酶和胞外酶，蔗糖酶系胞內(nèi)酶。提取胞內(nèi)酶時(shí)，要破碎組織和細(xì)胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料稱為無細(xì)胞抽提液。材料不同，破壁的方法也不同。我們用的菌體（微生物）細(xì)胞破壁方法是：自溶法，即將菌體放在適當(dāng)?shù)膒H值和溫度下，利用組織細(xì)胞自身的酶系將細(xì)胞壁破壞，使細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)釋放出來。自溶時(shí)需加少量防腐劑，以防外界細(xì)菌污染。自溶法的缺點(diǎn)是時(shí)間較長(zhǎng)。
2、3，5-二硝基水楊酸比色定糖的原理
（1）DNS試劑+ D-葡萄糖 氨基化合物
（還原糖） （棕紅色）
（2）在一定范圍內(nèi)還原糖的量與反應(yīng)液的顏色強(qiáng)度成一定比例關(guān)系（可用于比色測(cè)定），所以可用DNS比色法測(cè)定還原糖的含量。
（3）該方法是半微量定糖法，操作簡(jiǎn)便、快速、雜質(zhì)干擾較少。
試劑與器材
恒溫水浴、自動(dòng)部分收集器、恒溫箱、梯度洗脫裝置、冰箱、層析柱、分析天平、電磁攪拌器、秒表、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、凍干機(jī)、沸水浴等。3,5二硝基水楊酸試劑(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸鈉、0.2mol/L,pH4.6的醋酸緩沖液 6. 乙酸乙酯
操作方法
① 細(xì)胞破壁→抽提→兩次乙醇分級(jí)→透析→裝柱→洗滌→洗脫→收集酶活力峰→制凍干粉
② 制作3，5—二硝基水楊酸比色定糖法的標(biāo)準(zhǔn)曲線并測(cè)定三種酶樣品的活力
③ 測(cè)定三種酶樣品的蛋白濃度
④ 計(jì)算各步酶樣的比活力、提純倍數(shù)和收率
⑤ 用雙倒數(shù)作圖法測(cè)定蔗糖酶的Km值
關(guān)鍵步驟與注意事項(xiàng)
① 乙醇分級(jí)時(shí)，注意低溫、防止乙醇局部過濃，離心后要迅速溶解酶樣
② 裝柱均勻，無截面、無氣泡，床面平整，柱體垂直
③ 分離提純的全過程中，防止酶失活并用測(cè)定酶活力的方法跟蹤酶的去向
④ 在測(cè)定米氏常數(shù)時(shí)，將酶樣溶解后一定要稀釋到合適的濃度。
⑤ 酶活力測(cè)定及作圖一定要準(zhǔn)確。